近日，内蒙古民族大学动物科技学院王学理教授团队在农林科学一区Top 期刊《LWT - Food Science and Technology》在线发表了题为《Isolation and identification of a pathogenic strain of Bacillus cereus from bovine and establishment of a rapid detection method for RPA-LF》的研究论文。内蒙古民族大学动物科技学院21级兽医学硕士研究生孟庆磊为该论文的第一作者，王学理教授为该论文的通讯作者。该研究对一株致病性蜡样芽胞杆菌进行了分离鉴定，并开发了一种致病性蜡样芽胞杆菌的RPA-LF检测方法。RPA-LF检测法可以快速检测致病性蜡样芽胞杆菌，以降低该菌对人和动物健康的危害。

蜡样芽胞杆菌是一种常见的食源性条件致病菌，内蒙古东部地区已发现多起蜡样芽胞杆菌引发的牛猝死病例。该研究从一猝死牛脾脏内分离到一株细菌，经鉴定其为致病性蜡样芽胞杆菌。蜡样芽胞杆菌的传统检测方法耗时较长。为了满足快速准确的检测需求，该研究针对蜡样芽胞杆菌的nhe基因建立了RPA-LF检测法（原理图见图1），以期减少蜡样芽胞杆菌的危害，同时也为其他病原菌的快速检测提供了一定的参考。

分离菌株为革兰氏阳性杆菌，菌落呈灰白色、且菌落有较强的黏性（菌落呈蜡滴状）。镜检可见分离菌株大部分呈单个或链状排列（图2）。16S rDNA的PCR扩增结果可见一条大小约为1500 bp的条带（图3）。将16S rDNA的测序结果与不同来源的菌株进行同源性分析和比较，基因系统发育进化树的结果显示，分离菌株(OP028902)与山西分离株KX905299亲源关系最近（图4）。小鼠注射菌液后全部死亡，生理盐水对照组小鼠无异常。动物致病性试验表明分离菌株具有较强的致病性。分离的蜡样芽胞杆菌中含有持家基因groEL，溶血性肠毒素毒力基因hblA、hblC、hblD，非溶血性肠毒素毒力基因nheA、nheB、nheC以及肠毒素毒力基因entFM，不含有肠毒素毒力基因bceT、细胞毒素毒力基因cytK及呕吐毒素毒力基因ces（图5）。

为测试该研究中RPA-LF检测法的最适反应温度，将RPA反应产物添加至侧向横流试纸条2 min后，10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、45 ℃组试纸条检测线无条带，30 ℃组检测线出现颜色较浅条带，35 ℃、40 ℃组检测线明显（图6）。5 min后可见10 ℃、15 ℃组试纸条检测线无条带，20 ℃组与45 ℃组检测线出现颜色较浅条带，30 ℃、35 ℃、40 ℃组检测线明显。结果表明35-40 ℃为组内RPA最佳反应温度区间（其中38 ℃组的效果最好，故将该研究的反应温度设定为38 ℃）。

为测试该研究中RPA-LF检测法的最佳反应时间，将各反应时长下的RPA反应产物添加至侧向横流试纸条，5 min反应组检测试纸条出现颜色较浅的检测带，其余各组检测线均十分明显。此结果表明，5-10 min的反应时间为该研究的最低有效检测区域（图7）。设置6个试验组以进一步确定最佳反应时间 (6个试验组反应时间依次为5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min)。10 min组条带的清晰度明显高于其余试验组，因此10 min为此检测方法的最佳反应时间。

为测试该研究中RPA-LF检测法的特异性，选用了不同菌株和生理盐水进行对照。蜡样芽胞杆菌检测组试纸条上出现清晰的检测条带，其余各试验组均无检测条带出现（图8）。该检测方法具有较高的特异性。该研究中的RPA-LF检测法的灵敏性试验结果表明，该检测方法可对浓度达1.0×10² CFU/mL以上的蜡样芽胞杆菌进行检测（图9）。

综上可知，该研究对牛源蜡样芽胞杆菌(OP028902)进行了分离鉴定（致病性蜡样芽胞杆菌导致了牛的猝死）；该研究建立了蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素的RPA-LF快速检测法（RPA-LF检测方法，只需15 min即可检测浓度高于1.0×10² CFU/mL的蜡样芽孢杆菌，此检测方法的特异性良好），这为致病性蜡样芽胞杆菌的快速检测提供了参考，也为其他病原菌的快速检测提供了一定的参考。

   该项目获得内蒙古自治区高等学校科学技术研究重点项目(NJZZ19147)，内蒙古自然科学基金(2021LHMS03008)，内蒙古直属高校基本科研业务费多学科交叉研究项目(GXKY22003)的共同资助。

图1. RPA-LF示意图

图2. 细菌分离菌株在显微镜下的形态(1000×)

图3. 细菌分离菌株的16S rDNA检测结果

M: DL2000 DNAMarker, 16S: 16S rDNA

图4. 16S rDNA基因系统发育进化树

图5. 细菌分离株毒力基因扩增结果

M: DL2000 DNAMarker, 1: nheA gene, 2: nheB gene, 3: nheC gene, 4: hblA gene, 5: hblC gene, 6: hblD gene, 7: ces gene, 8: entFM gene, 9: cytK gene, 10: bceT gene, 11: groEL gene

图6. RPA-LF法不同温度组的测试结果

1: 10 ℃组, 2: 15 ℃组, 3: 20 ℃组, 4: 25 ℃组, 5: 30 ℃组, 6: 35 ℃组, 7: 40 ℃组, 8: 45 ℃组

图7. RPA-LF法不同反应时间的测试结果

1: 5 min组, 2: 10 min组, 3: 15 min组, 4: 20 min组, 5: 25 min组, 6: 30 min组

图8. RPA-LF法特异性的检测结果

1: 蜡样芽胞杆菌组, 2: 产气荚膜梭菌组, 3: 巨大芽胞杆菌组, 4: 枯草芽胞杆菌组, 5: 生理盐水

对照组

图9. RPA-LF法灵敏性的检测结果

1: 生理盐水, 2: 1.0×10¹ CFU/mL, 3: 1.0×10² CFU/mL, 4: 1.0×10³ CFU/mL, 5: 1.0×10⁴ CFU/mL, 6: 1.0×10⁵ CFU/mL, 7: 1.0×10⁶ CFU/mL, 8: 1.0×10⁷ CFU/mL

    论文链接：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.115259